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裂褶菌漆酶对造纸废水深度处理

作者: 时间:2022-12-01 16:03:18 点击:


造纸工业是环境污染大户,生产过程中化学制浆、洗浆、漂白以及抄纸工序会产生大量的废水。化学制浆产生的黑(红)液废水与抄纸白水,可通过常规的碱回收工艺以及气浮、过滤等处理后直接回用于生产。洗浆、漂白段产生的中段废水污染物成份复杂,除含有高浓度的较难生物降解的木质素、纤维素外,还含有对环境危害极大的低分子量氯代酚和色度很高的高分子量氯代木素衍生物、糖类、残碱、无机盐、挥发酸等,这段废水 COD 高、 pH 变化幅度大、色度高、可生化性差,处理难度大,是真正意义上的造纸废水。当前,采用常规的一级沉降与二级生化处理后,造纸废水的污染负荷大幅降低,虽然也达到了外排标准,但水的色度与 COD 值仍然较高,水中仍含有一定量毒性很高的可溶性木素衍生物与多酚类物质,不仅达不到回用标准,外排还会对生态环境造成极大危害,因此,研究造纸废水的深度处理就显得非常必要。

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,参与木素的降解或聚合,具有氧化木素的能力。在有氧条件下,漆酶能使造纸废水中的木素衍生物和多酚类化合物发生氧化降解或聚合,进而通过絮凝沉淀或深度氧化除去,基于此,近年来用漆酶及产漆酶白腐菌深度处理造纸废水成为研究热点并取得了良好的效果。裂褶菌是一种珍贵的食、药两用真菌,研究证明,裂褶菌能分泌高活性的漆酶,而且裂褶菌漆酶在对纺织品染料进行脱色以及废新闻纸的脱墨方面表现出良好的应用效果,但有关裂褶菌漆酶应用于造纸废水处理方面的文献并未见报道。

本文在前期筛选到一株产漆酶裂褶菌 mys005 并通过液体发酵培养得到了高活力漆酶的基础上,主要开展裂褶菌 mys005 漆酶的酶学特性及深度处理造纸废水最佳工艺条件研究,以期为其工业化应用积累数据并为应用企业提供参考。

1 、材料与方法

1.1

产漆酶菌种

采自秦岭骊山,在愈创木酚 -PDA 培养基平板上产生深棕红色变色圈,在α - 萘酚 PDA 培养基平板上不产生变色圈;真菌 ITS 分子鉴定为裂褶菌( Schizo ⁃ phyllumcommuneFr. ) , 所内编号 mys005 。

造纸废水取自陕西某废纸制浆造纸厂综合废水经生化处理后的二沉池出水(废水水质:木素 121mg/L ,色度(倍) 238 , COD304mg/L , pH6.7 )。

1.2

药品、仪器与设备

实验所用到的药品均为分析纯(天津百世化工)与生化级试剂(北京奧博星); ABTS ( 2,2- 联氮 - 二 (3- 乙基 - 苯并噻唑 -6- 磺酸 ) 二铵盐)为 Sigma 试剂; HBT ( 1- 羟基苯并三唑)购自国药集团试剂公司; BeckmanDU640 紫外分光光度计;愠温摇床: KYC-1102 上海新苗医疗器械有限公司;愠温培养箱: PYS-DHS 上海跃进医疗器械厂;恒温水浴箱: HH • W21 • 600S 上海跃进医疗器械厂。

1.3

方法

1.3.1

漆酶液的制备

mys005 斜面菌种用 PDA 平板活化 2~3d 后无菌操作打成¢ 6mm 菌饼,接入摇瓶( 500mL 锥形瓶装培养液 150mL ,接菌饼 5 片 / 瓶),于 30 ℃摇床 200r/min 培养 9d ,发酵液先用脱脂棉过滤然后再于 10000r/min 离心 10min 得漆酶液。摇瓶培养基( 20% 马铃薯滤汁 1000mL 、 K2HPO4 • 3H2O1.00g 、 NaCl0.50g 、 MgSO4 • 7H2O0.50g 、 NaNO32.50g 、 CaCl2 • 2H2O0.10g 、 FeCl30.02g 、吐温 -801.20mL ,微量元素复合液( 50mg/mLCuCl2 • 2H2O+20mg/mLMnSO4 • 7H2O+10mg/mLZnSO4 • 7H2O ) 3mL 、洋葱 100g (切碎)、麦麸 10g ), pH4.5 , 121 ℃灭菌 20min 。

1.3.2

漆酶活测定方法: ABTS 法

酶活定义:以每 min 转化 1 μ mol/LABTS 的酶量为一个酶活单位( U )。

1.3.3

漆酶酶学特性研究

1.3.3.1

漆酶最适反应温度

用 1.3.2 节方法,选择在不同温度下测定酶活,活力最高者为 100% 。

1.3.3.2

漆酶最适反应 pH

用 1.3.2 节方法,选择用不同 pH 的醋酸—醋酸钠缓冲液测定酶活,活力最高者为 100% 。

1.3.3.3

漆酶的热稳定性

取酶液在不同温度下分别保温不同时间,然后迅速冷却到室温,用 1.3.2 节方法测定酶活,以 30 ℃测定的未保温处理酶样的酶活为 100% 。

1.3.4

漆酶处理造纸废水研究

1.3.4.1

废水处理方法

取 200mL 废水样于 500mL 锥形瓶中,调节 pH ,加入适量的漆酶液及介体 HBT 与水样混匀,置于恒温水浴进行处理,期间不间断摇匀水样,处理完成后将水样用 6 层纱布过滤,收集上清液用于测定木素含量、 COD 及色度,计算降解率。

1.3.4.2

废水木素含量的测定

由于木素的紫外吸收光谱在 280nm 处有特征吸收峰,因此,可以在波长 280nm 下定量地测定水样中木素的含量(浓度)。计算公式如下:


裂褶菌漆酶对造纸废水深度处理(图1)

式中: A 为吸光度; a 为吸收系数,此水样吸收系数采用 26.1L/ ( g • cm ); b 为比色皿的厚度 1cm ; c 为测定水样中木素吸收浓度, g/L 。

木素降解率( % ) = × 100

1.3.4.3

废水 COD 和色度的测定

COD 的测定采用重铬酸钾法( GB/T11914-1989 )。色度测定采用稀释倍数法( GB/T11903-1989 )。

COD 降解率( % ) = × 100

色度降解率( % ) = × 100

2 、结果与分析

2.1

裂褶菌 mys005 漆酶酶学特性

由于不同菌种来源的漆酶具有其不同的最适反应温度、最适 pH 、酶的热稳定性等酶学特性,应用时要使酶发挥最佳催化效率,取得最佳处理效果,就有必要先对其酶学特性进行研究。

2.1.1 mys005 漆酶最适反应温度

将酶反应温度分别设定为 30 、 35 、 40 、 45 、 50 、 55 、 60 、 65 、 70 、 75 、 80 ℃测定漆酶活,以酶活力最高者为 100% 。结果如图 1 ,裂褶菌 mys005 漆酶最适反应温度为 70 ℃,适宜反应温度范围为 65~75 ℃。


裂褶菌漆酶对造纸废水深度处理(图2)

2.1.2 mys005 漆酶最适反应 pH

分别配制 pH 为 3.5 、 4.0 、 4.5 、 5.0 、 5.5 、 6.0 的醋酸—醋酸钠缓冲溶液用于测定酶活,以酶活力最高者为 100% 。结果如图 2 ,可以看出 mys005 漆酶最适反应 pH 为 4.5 ,同时可看出 mys005 漆酶具有较宽的 pH 反应范围,在 pH3.5~5.5 间, mys005 漆酶均能保持比较高的活性,这将大大有利于该漆酶的工业化应用。


裂褶菌漆酶对造纸废水深度处理(图3)

2.1.3 mys005 漆酶的热稳定性

将漆酶液在 40 、 50 、 60 、 70 、 80 ℃下分别保温 30 、 60 、 90 、 120min 后测定酶活,以 30 ℃测定的未进行热处理所测酶活为 100% 。结果如图 3 ,可看出 mys005 漆酶在低于 50 ℃下具有良好的热稳定性,酶液在 40 ℃保温 2h 仍有 92% 的活力,在 50 ℃保温 2h 酶活保存率仍达 83% ,但当处理温度达到 60 ℃时,酶活损失较快,保温 2h 酶活损失了 53% ,当处理温度高于 70 ℃时酶开始迅速失活,高于 80 ℃时,保温处理 30min 酶活损失至 0 。另外,由图 3 可见:在 40~50 ℃下,保温 30min ,酶活反而增加了 20% 左右,这一结果与有关报道中热激对漆酶活有促进作用相一致。综合考虑漆酶的活性和热稳定性,确定 mys005 漆酶的使用温度不要超过 60 ℃,以 40~50 ℃为最佳。


裂褶菌漆酶对造纸废水深度处理(图4)

2.2 mys005 漆酶深度处理造纸废水

2.2.1 mys005 漆酶处理废水最佳处理温度与最佳处理时间的确定

因为 mys005 漆酶的适宜反应 pH 范围为 3.5~5.5 ,最适使用温度范围为 40~50 ℃,故此处初步设定酶处理废水的 pH 值为 5.0 。

取 4 份 200mL 的水样,用稀 HCl 调水样 pH 为 5.0 ,加入漆酶液使反应体系中酶的终浓度为 50U/mL ,加入介体 HBT5mg/L ,设定 40 、 45 、 50 、 55 ℃不同温度进行处理,测定不同处理时间( 1 、 2 、 3 、 4 、 5 、 6h )后各水样中木素含量、 COD 和色度值,计算降解率,以此确定最佳处理温度与处理时间。结果如图 4~6 所示。


裂褶菌漆酶对造纸废水深度处理(图5)


裂褶菌漆酶对造纸废水深度处理(图6)


裂褶菌漆酶对造纸废水深度处理(图7)

从图 4 、 5 、 6 中可以看出,在 pH5.0 ,处理温度 40~55 ℃的范围内, mys005 漆酶都能有效降低废水的木素与 COD 含量,总的趋势是:从 40~50 ℃,处理温度越高,木素、色度与 COD 的降解率越高,用时越短,其中以 50 ℃处理效果最好,处理 4h ,木素、色度及 COD 的降解率分别达到了 72.3% 、 79.1% 和 59.3% 。而当处理温度为 40 ℃时,由于温度偏低,降解速率较慢,处理 6h 后,木素、色度及 COD 的降解率分别仅为 52.7% 、 55.3% 和 41.4% ;当处理温度为 55 ℃时,由于超出了酶的最适反应温度,漆酶失活较快,处理 3h 后木素、色度及 COD 的降解率基本已接近最高值,其后虽然延长了处理时间,但降解率增值非常有限,最终处理效果远低于 50 ℃时的效果。因此,确定 mys005 漆酶处理废水的最佳温度与时间分别为 50 ℃与 4h 。

2.2.2 mys005 漆酶处理废水最佳 pH 的确定

取 6 份 200mL 的水样,分别用稀 HCl 调整水样 pH 为 4.0 、 4.5 、 5.0 、 5.5 、 6.0 、 6.5 ,加入漆酶液使反应体系中酶的终浓度为 50U/mL ,加入介体 HBT5mg/L, 调恒温水浴为 50 ℃ , 反应 4h 后测定各水样中木素含量、 COD 和色度值,计算降解率,以此确定处理废水的最佳 pH 。结果如图 7 所示。


裂褶菌漆酶对造纸废水深度处理(图8)

由图 7 可看出,从 pH4.0~6.5 ,随着处理体系 pH 的上升,废水中木素、色度与 COD 的降解率都是先上升后下降,三者都在 pH5.0 时达到最高值,分别为 74.2% 、 79.9% 与 59.8% 。同时还可看出当处理 pH 为 4.5 与 5.5 时,虽然木素、色度与 COD 的降解率不如 pH5.0 时高,但数值相差不大非常接近。综合考虑因废水样的 pH 为 6.7 ,为了减少调整 pH 所用酸的加入量,最终选择处理废水的最佳 pH 为 5.5 。

2.2.3 mys005 漆酶处理废水最佳酶用量的确定

取 5 份 200mL 的水样,用稀 HCl 调 pH 为 5.5 ,调恒温水浴 50 ℃ , 加入介体 HBT5mg/L, 加入漆酶液使反应体系中酶的终浓度分别为 30 、 40 、 50 、 60 、 70U/mL ,反应 4h 后测定各水样中木素含量、 COD 和色度值,计算降解率,以此确定处理废水的最佳酶用量。结果如图 8 所示。


裂褶菌漆酶对造纸废水深度处理(图9)

由图 8 可看出,酶用量对废水处理效果有较大影响,开始随着漆酶用量的增加,处理效果不断变好,废水中木素、色度与 COD 的降解率持续上升,但当酶用量达到 40U/mL 时,即使再增加酶的用量,三者的降解率增加却不再明显,据此确定漆酶的最佳用量为 40U/mL ,此时木素、色度与 COD 的降解率分别为 74.1% 、 78.0% 与 57.2% 。

2.2.4 mys005 漆酶处理废水最佳 HBT 用量的确定

漆酶介体是一类特殊的小分子物质,它与漆酶共同构成漆酶—介质体系 (Laccase-MediatorSystem , LMS) ,通过间接提高漆酶的氧化还原电势和减少漆酶与底物之间的空间阻碍等方式提高漆酶对目标底物的催化氧化效率。 HBT( 一羟基苯并三氮唑 ) 是一种常见的人工合成的漆酶催化氧化介体物质,它具有 N-OH 基,做为漆酶介体时会产生氮氧自由基,夺取底物上的氢,形成苄基自由基,使底物化学键断裂,从而提高漆酶的催化效率。有研究证明,白腐菌漆酶— HBT 介体体系能对造纸废水进行有效处理;介体 HBT 能辅助漆酶降解蒽,漆酶与 ABTS 、 HBT 组成的复合介体系统能对菲进行氧化。

取 7 份 200mL 的水样,用稀 HCl 调 pH5.5 ,调恒温水浴 50 ℃ , 加入漆酶液使反应体系中酶的终浓度为 40U/mL ,分别加入介体 HBT0 、 2 、 4 、 5 、 6 、 7 、 8mg/L 进行处理, 4h 后测定各水样中木素含量、 COD 和色度值,计算降解率,以此确定处理废水的最佳 HBT 添加量。结果如图 9 所示。


裂褶菌漆酶对造纸废水深度处理(图10)

由图 9 可看出,添加介体 HBT 能大幅提高 mys005 漆酶处理废水中木素、色度及 COD 的降解率,当反应体系不添加 HBT 时,废水木素、色度与 COD 的降解率分别仅为 18.7% , 23.1% 和 14.6% ;添加介体 HBT 后,随着 HBT 用量的增加三者的降解率呈现出先快速上升而后趋于稳定的趋势,其中当 HBT 用量为 6mg/L 时,处理效果达到最佳,此时木素、色度及 COD 的降解率分别达到了 77.8% , 80.7% , 60.7% 。故此确定介体 HBT 的最佳用量为 6mg/L 。

2.2.5 mys005 漆酶处理造纸废水放大验证实验

取 3 份 2000mL 的水样,用稀 HCl 调 pH5.5 ,调恒温水浴 50 ℃,分别加入漆酶液与介体 HBT 使各自反应体系中酶与 HBT 的终浓度分别为 40U/mL 与 6mg/L ,开始反应, 4h 后测定各水样中木素含量、 COD 和色度值,计算降解率。结果如表 1 所示。


裂褶菌漆酶对造纸废水深度处理(图11)

由表 1 放大验证实验结果可以看出, mys005 漆酶能够对造纸厂二沉池废水进行有效的深度处理,在合适的处理条件下,处理废水的木素、色度及 COD 的降解率分别达到了 77.5% 、 81.1% 和 61.1% 。

3 、小结

( 1 )裂褶菌 mys005 漆酶最适反应 pH 为 4.5 ,且在 pH3.5~5.5 间酶活稳定性良好;最适反应温度为 70 ℃;在低于 50 ℃下具有良好的热稳定性,使用温度以 40~50 ℃为最佳,不要超过 60 ℃。 mys005 漆酶与其它真菌漆酶一样属于一种酸性酶,但与其它白腐真菌来源的漆酶比较,其具有较宽的 pH 应用范围、较高的最适反应温度与较好的热稳定性,这都大大便利于其储存运输及工业化实际应用。

( 2 )裂褶菌 mys005 漆酶能对废纸造纸厂经生化处理后的二沉池废水进行有效深度处理,其中处理温度、处理时间、 pH 、酶用量及介体用量都会对处理效果产生重要影响;当处理温度为 50 ℃, pH5.5 ,酶用量 40U/mL , HBT 用量 6mg/L ,处理 4h 后,废水的木素、色度与 COD 的降解率分别达到了 77.5% 、 81.1% 和 61.1% ,表现出了较好的工业应用潜力。(来源:陕西省生物农业研究所,陕西省酶工程技术研究中心,中国科学院西北生物农业中心)


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